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中药有效成分常见色谱前处理方法

点击次数:2787 更新时间:2009-11-23

中药有效成分常见色谱前处理方法

*步:提取法:   用相应的溶剂使有效成分溶解出来的,溶剂根据有机物的性质来选择。可以冷浸,如果稳定性允许,为加速溶解的过程,可采用超声处理,加热回流(包括索氏提取)。选择适当的溶剂可以减少杂质。基本原则是能用纯的甲、乙醇不用带水的,能用非极性的不用极性的,因为消除极性杂质一般比非极性的麻烦。根据相似相溶的原则,非极性溶剂溶解的极性物质较少。  蒸馏(多为水蒸气蒸馏)也较多使用,同时具有提取和一定的分离作用。  某些物质还可以用升华法:樟脑,咖啡碱(178℃以上就能升华而不被分解)等。升华法易产生挥发性的焦油状物,粘附在升华物上,不易除去,另外,升华不*,甚至会分解,不能用于含量测定。  

第二步:分离和纯化:

1、液液萃取  基本上都是水溶后,用乙酸乙酯、乙醚、氯仿、石油醚等与水不相溶的有机溶剂。一般分析的量较少,微溶于水的物质都可以用液液萃取的方法。通过合适的酸化/碱化步骤,可有效的去除杂质。

2、沉淀  利用重金属等与待分析物形成络和物或难溶盐沉淀而分离,然后再用酸、碱等把它还原出来。铅盐常用以沉淀有机酸、氨基酸、蛋白质、粘液质、鞣质、树脂、酸性皂甙、部分黄酮等。例如含绿原酸的溶液加醋酸铅溶液,搅拌使沉淀,离心,弃去上清液,沉淀物加5%硫酸溶液,用醋酸乙酯萃取。常用雷氏铵盐使生成生物碱沉淀析出。橙皮甙、芦丁、黄芩甙均易溶于碱性溶液,加入酸后可使之沉淀析出。某些蛋白质,可以变溶液的pH值利用其在等电点时溶解度zui小的性质而使之沉淀析出。此外,还可以用明胶、蛋白溶液沉淀鞣质;胆甾醇也常用以沉淀洋地黄皂甙等。

3、析出法:包括盐析和改变溶剂极性析出。  盐析法是在水溶液中、加入无机盐,可使某些成分在水中的溶解度降低沉淀析出,而与水溶性大的杂质分离。常用作盐析的无机盐有氯化钠、硫酸钠、硫酸镁、硫酸铵等。三七皂甙乙、掌叶防己碱,小檗碱等都可以用种方法。不过,一般分析上是在水溶液中加入一定量的食盐,再用有机溶剂萃取,例如麻黄碱、苦参碱等水溶性较大的物质。  改变溶剂极性析出是在溶液中加入不同极性的溶剂是物质析出。就像生产中水提醇沉、醇提水沉。   

4、柱色谱法:  常用的固定相有硅胶、氧化铝、聚酰胺、大孔树脂、活性炭、硅藻土等。柱色谱法有两种,是简单的吸附解吸,理论塔板数相当于一,跟萃取差不多,也可称富集,例如像现在用得很广的SPE(solid phase extract)。另外一种则是像色谱Tswett那样,样品加在柱上形成一窄带,然后再分步或连续洗脱。  *种较简单,活化后,按要求预处理,然后让样品溶液通过吸附剂,吸附饱和后,根据不同物质的解吸条件,选择不同吸脱溶剂吸脱下来。关于SPE小柱的使用这里不介绍了,仅举一更实际的例子:取天麻细粉5g,加甲醇50ml,水浴加热回流1小时,过滤,滤液蒸干,残渣加水30ml溶解,用氯仿萃取2次,每次10ml,弃去氯仿液。水液加热挥去残余氯仿,加活性炭(不活化)2g,微沸20分钟,放冷,加硅藻土1g,搅拌均匀,用滤纸过滤,再以40ml水洗涤残渣,滤液弃去;残渣于水浴上干燥半小时,然后置锥形瓶中,加无水乙醇50ml,回流半小时,过滤,滤液浓缩至干,加甲醇1ml使溶解,作为供试品溶液。其实,如果不是含量测定的话,上面的做法可以达到目的。如果是含量测定,那就要用柱子,并确定一下吸附剂的使用量,防止待测物损失。  第二种方法,zui重要的是让样品在柱上形成窄带。我们可以近似的认为,窄带的高度相当于理论塔板高度,柱长除以理论塔板高度就是理论塔板数了。实际上洗脱时,待测成分在柱上的实际高度不一定等于窄带的高度。如果用洗脱剂直接溶解样品,就可以直接上柱了。如果不是的话,就要用一定的吸附剂吸附样品,在把样品的溶剂挥干后,在加到柱子。洗脱条件应通过实验确定,包括洗脱溶剂、洗脱体积、洗脱速度。  根据不同的吸附剂,具体的应用不同: (1)硅胶:硅胶颗粒表面有很多硅醇基。硅胶吸附作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键作用吸附水分而降低吸附能力,硅胶的吸附性根据其含水量不同分成多个级别。硅胶的活化:100~110℃时,硅胶表面水分即能被除去;500℃时,硅胶表面的硅醇基脱水缩合转变为硅氧烷键,失去吸附性。硅胶是酸性吸附剂,用于中性或酸性成分分离。不活化的硅胶,可利用分配原理分离色素。硅胶又是一种弱酸性阳离子交换剂,其表面上的硅醇基能释放弱酸性的氢离子,所以可作为离子交换剂,分离碱性化合物。吸附硅胶柱的洗脱溶剂成很多,从非极性到极性的顺序洗脱。 (2)氧化铝:氧化铝偏碱碱性,zui适宜用于生物碱类的分离,不宜用于醛、酮、醋、内酯等类型的化合物分离。氧化铝用水洗至中性,称为中性氧化铝,中性氧化铝适用于酸性成分的分离。氧化铝用稀硝酸或稀盐酸处理,可使氧化铝颗粒表面带有硝酸根或氯离子,制成酸性氧化铝,酸性氧化铝具有离于交换剂的性质。中性氧化铝使用zui多,柱层析用的中性氧化铝粒度应在100~200目之间。粒度大,分离效果差:小则洗脱速度慢,纵向扩散。中性氧化铝的活化与硅胶差不多。中性氧化铝柱的洗脱溶剂溶剂组成很多,从非极性到极性的顺序洗脱。 (3)聚酰胺:尼龙与酰胺类化合物形成的高分子聚合物,分子上有很多酰胺基,可与酚类、酸类、醌类、硝基化合物形成氢键。适用于酚性化合物如黄酮的分离。一般聚酰胺不需活化或预处理就可以装柱。提取液或提取物上柱后,用水洗杂质,用不同比例的醇的水溶液从低浓度到高浓度依次洗脱。 (4)大孔树脂:具有立体结构的多孔性聚合物,有巨大的比表面积,通过范德华力吸附有机物。以前的大孔树脂多用汽油等作致孔剂,需要用丙酮加热回流来预处理,现在可购买纯度较高的,使用前只需用甲醇、或乙醇洗涤至洗出液滴在水中不产生白色即可。再生树脂的方法是,用2%~5%的盐酸浸泡洗涤,用水洗到中性,然后用5%氢氧化钠浸泡洗涤,用水洗到中性即可。树脂含水量70%左右,如不慎树脂干了,可用乙醇或丙酮浸渍处理,然后再用。按实际情况,酸、碱浓度可增减。大孔树脂类型很多,zui多用的是D101。多用于皂苷、黄酮、内酯、萜类和色素的分离。提取液或提取物上柱后,用水洗杂质,用不同比例的醇的水溶液从低浓度到高浓度依次洗脱。 (5)活性炭:一般需要先用稀盐酸洗涤,其次用乙醇洗,再以水洗净,于80℃干燥后再用。上柱用的活性炭,选用颗粒活注炭,若为活性炭细粉,则需加入适量硅藻土作为助滤剂一并装柱,以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分。活性炭对芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开,单糖与多糖分开,氨基酸与多肽分开。提取液或提取物上柱后,用水洗杂质,用不同比例的醇的水溶液从低浓度到高浓度依次洗脱。 (6)硅藻土:采用不同pH缓冲液的硅藻土分配色谱柱,可分离生物碱、酸性生物碱和中性物质。提取液或提取物上柱后,用乙醚或氯仿洗下色素、脂肪、中性杂志,然后用胺性醇洗下生物碱。    十八烷基硅烷基硅烷碱合硅胶、其它类型键合硅胶、DEAE纤维素、其他纤维素、离子交换树脂应用的较少,这里略去。

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